姜自红;刘文干;孙钦花;

• 1:滁州职业技术学院食品与环境工程学院
• 2:安徽安龙基因科技有限公司
• 3:徐州工程学院环境工程学院

摘要(Abstract)：

菊花B病毒（Chrysanthemum virus B, CVB）和番茄不孕病毒（Tomato aspermy virus, TAV）是危害菊花的2种主要优势病毒。为构建一种同步检测CVB和TAV逆转录重组酶聚合酶恒温核酸扩增（Reverse transcriptionrecombinase polymerase amplification, RT-RPA）双重荧光实时检测方法，本研究以CVB和TAV编码外壳蛋白（coat protein, CP）基因保守区域作为靶标设计RIA引物和探针，CVB和TAV探针的5’端分别标记FAM和VIC荧光素，通过对商业化的RT-RPA试剂筛选，引物探针的组合筛选，扩增体系的优化和扩增条件的摸索试验，构建了一种可同时用于CVB和TAV检测的RT-RPA双重荧光实时检测方法。并对该体系进行优化，优化后RT-RPA双重荧光扩增体系中CVB和TAV的最优引物浓度为400 nmol/L，最优探针浓度分别为100 nmol/L和120 nmol/L；最适反应温度为39℃，最适反应时间为15 min。在此扩增体系和条件下，对CVB和TAV的检测敏感性均为1拷贝/μL；对烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯X病毒、菊花矮化类病毒和褪绿斑驳类病毒核酸检测结果为阴性，对菊花B病毒、番茄不孕病毒核酸检测结果为阳性；对1.0×10⁴拷贝/μL和10拷贝/μL的高、低两种浓度的质粒平行检测10次，检测荧光出现阳性扩增拐点所需的时间T变异系数均小于5%，重复性好。采用RTRPA和RT-qPCR方法同步对实验室留存的有症状的100株菊花进行核酸提取并检测，检出6例CVB病毒株和4例TAV病毒株，总符合率100%。因此，本研究建立了一种能同时检测CVB和TAV的快速、灵敏的RT-RPA双重荧光实时检测方法。

关键词(KeyWords)： 菊花B病毒;番茄不孕病毒;逆转录重组酶聚合酶恒温扩增(RT-RPA);双重荧光实时检测

Abstract:

Keywords:

基金项目(Foundation): 安徽高校自然科学研究重大项目（项目号：KJ2021ZD0161）,题目：菊花B病毒和番茄不孕病毒RT-RPA双重荧光检测体系的构建与性能评价~~

作者(Authors): 姜自红;刘文干;孙钦花;

DOI: 10.13242/j.cnki.bingduxuebao.004247

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