张利英,王森,陈东亮,喻锌,姜宝龙,程钰涵,李彦慧,黄丛林

• 1:北京市农林科学院草业花卉与景观生态研究所
• 2:北京市功能花卉工程技术研究中心
• 3:河北农业大学园林与旅游学院
• 4:北京金沙生物科技有限公司

摘要(Abstract)：

菊花是世界最重要的园艺作物之一，兼具有茶用、药用、食用及观赏等多种经济价值。我国是栽培菊花的起源地，也是主要种植生产区。病毒病害是菊花生产过程中最主要病害，目前已知的菊花病毒及类病毒有20多种，对菊花产业危害巨大。建立快速、高效的检测方法是病害防控的必要条件。前期调查显示番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt orthotospovirus,TSWV）、番茄不孕病毒（Tomato aspermy virus,TAV）、菊花B病毒（Chrysanthemum virus B,CVB）、菊花矮化类病毒（Chrysanthemum stunt viroid,CSVd）和菊花褪绿斑驳类病毒（Chrysanthemum chlorotic mottle viroid,CChMVd）是北京地区菊花中主要病毒及类病毒种类。自NCBI数据库下载以上病毒/类病毒的基因序列，利用不同病毒保守区域，设计开发出特异性引物，建立了5种病毒/类病毒同时检测的多重RT-PCR体系；并对反应体系中引物对的含量配比、退火温度、模板含量等因子进行了优化。试验结果显示，TSWV、TAV、CVB、CChMVd、CSVd的引物对浓度分别为300 nmol/L、50 nmol/L、200 nmol/L、700 nmol/L、600 nmol/L，模板用量0.5 ng/μL，退火温度55.3℃时，可以同时扩增出片段大小为分别485 bp、376 bp、292 bp、220 bp、110 bp的目的条带，特异性良好，结果判读简单清晰。进一步的比较分析显示，其与单一病毒检测的RT-PCR体系的检测灵敏性相当。综上，本研究构建的多重RT-PCR体系可以高效、快速、灵敏的检测菊花中常见的5种病毒及类病毒，并且检测成本大幅降低，为病毒的快速、低成本检测提供了方法。

关键词(KeyWords)： 菊花;病毒;类病毒;多重RT-PCR

Abstract:

Keywords:

基金项目(Foundation): 现代农业产业技术体系北京市创新团队项目（项目号：BAIC09-2023,题目：北京市景观休闲农业创新团队~~

作者(Author): 张利英,王森,陈东亮,喻锌,姜宝龙,程钰涵,李彦慧,黄丛林

DOI: 10.13242/j.cnki.bingduxuebao.004366

参考文献(References)：

• [1]刘舟，彭秋平，向云亚，李黎明.我国常见药用植物病毒病的危害与防控[J/OL].植物保护，2018, 44(1):9-19+44. DOI:10.16688/j.zwbh.2017380.
• [2]刘兴亮.菊花病毒和类病毒病原鉴定及其分子诊断方法研究[D].北京：中国农业大学，2014.
• [3]叶琪明，郭方其，吴超，丁晓瑜，徐杨.浙江省菊花病害种类及危害特征与分布调查[J/OL].江西农业学报，2019, 31(3):82-86. DOI:10.19386/j. cnki.jxnyxb.2019.03.15.
• [4]裴燕妮，咸珅，齐永红，张丽，王德富，牛颜冰.菊花R病毒杭白菊分离株全基因组序列测定与分析[J/OL].中国生物化学与分子生物学报，2020, 36(2):217-224. DOI:10.13865/j.cnki.cjbmb.2019.12.1424.
• [5] Guan Z Y, Wu D, Song A P, Chen F D, Chen S M,Fang W M. A highly sensitive method for the detection of Chrysanthemum virus B[J/OL]. Electron J Biotechnol, 2017, 26:64-68. DOI:10.1016/j.ejbt.2017.01.003.
• [6]雷强，李旻，丁元明，王云月.菊花上2种病毒的检测及其部分外壳蛋白基因序列分析[J/OL].华中农业大学学报，2012, 31(6):704-709. DOI:10.13300/j.cnki.hnlkxb.2012.06.008.
• [7] Zhao X T, Liu X L, Ge B B, Li M J, Hong B. A multiplex RT-PCR for simultaneous detection and identification of five viruses and two viroids infecting chrysanthemum[J/OL]. Arch Virol, 2015, 160(5):1145-1152. DOI:10.1007/s00705-015-2360-z.
• [8] Chen D L, Luo C, Liu H, Li M X, Cheng X, Li Y M,Wang L L, Huang C L. First report of chrysanthemum stem blight and dieback caused by tomato spotted wilt virus in China[J]. Plant Dis, 2018, 102(5):1047.
• [9] Xiao L, Li Y Y, Lan P X, Tan G L, Ding M, Li R H,Li F. First report of Tomato spotted wilt virus infecting cowpea in China[J]. Plant Dis, 2016, 100(1):233-233.
• [10]李飞，吴青君，徐宝云，谢文，王少丽，张友军.北京地区发现番茄斑萎病毒[J/OL].植物保护，2012, 38(6):186-188+191. DOI:CNKI:SUN:ZWBH. 0.2012-06-042.
• [11]Health E. Scientific Opinion on the risk to plant health posed by Chrysanthemum stunt viroid for the EU territory, with identification and evaluation of risk reduction options[J]. EFSA J, 2012, 10(12):3028.DOI:10.2903/j.efsa.2012.3027.
• [12]Park J, Jung Y, Kil E-J, Kim J, Thi Tran D, Choi SK, Yoon J-Y, Cho W K, Lee, S. Loop-mediated isothermal amplification for the rapid detection of chrysanthemum chlorotic mottle viroid(CChMVd)[J/OL]. J Virol Methods, 2013, 193(1), 232-237. DOI:10.1016/j.jviromet.2013.05.016.
• [13]Chinnaiah S, Ganesan M V, Sevugapperumal N,Mariappan S, Uthandi S, Perumal R. A sequel study on the occurrence of Tomato spotted wilt virus(TSWV)in cut-chrysanthemum by DAS-ELISA using recombinant nucleocapsid protein to produce polyclonal antiserum[J].J Virol Methods, 2022, 300:114410. DOI:10.1016/j.jviromet.2021.114410.
• [14]张志想，葛蓓孛，潘嵩，赵哲，王红清，李世访.菊花矮化类病毒的分子检测与序列分析[J/OL].园艺学报，2011, 38(12):2349-2356. DOI:10.16420/j.issn.0513-353x.2011.12.005.
• [15]颜琛娜，王永勤，杨清，张秀海，吴忠义，黄丛林.两重RT-PCR同步检测菊花B病毒和番茄不孕病毒[J/OL].植物保护，2009, 35(3):89-90. DOI:10.3969/j.issn.0529-1542.2009.03.022.
• [16]Zhao X T, Liu X L, Ge B B, Li M J, Hong B. A multiplex RT-PCR for simultaneous detection and identification of five viruses and two viroids infecting chrysanthemum[J/OL]. Arch Virol, 2015, 160(5):1145-1152. DOI:10.1007/s00705-015-2360-z.
• [17]Alvarez-Diaz J C, Ortiz-Echeverry B A, Velasquez N.Duplex RT-PCR assay for simultaneous detection of TSWV and CSVd in chrysanthemum[J/OL]. J Virol Methods, 2019, 266:41-48. DOI:10.1016/j.jviromet.2018.
• [18]杨相昆，田海燕，牛建新，王林，代永欣.葡萄病毒B的RT-PCR检测技术研究[J/OL].生物技术通报，2010,(5):97-100+106. DOI:CNKI:SUN:SWJT.0.2010-05-020.
• [19]金鑫，张艳慧，唐萌，周彦.柑橘病毒类病害诊断技术研究进展[J/OL].园艺学报，2016, 43(9):1675-1687.DOI:10.16420/j.issn.0513-353x.2016-0189.
• [20]Schoen C D, Leone G. Towards molecular detection methods for aphid-borne strawberry viruses[J/OL].Acta Hortic, 1995(385):55-63. DOI:10.17660/actahortic.1995.385.6.
• [21]孙伟，焦奎.酶联免疫吸附分析法在植物病毒检测中的应用[J/OL].化学研究与应用，2002(5):511-514+510. DOI:10.3969/j.issn.1004-1656.2002.05.004.
• [22]Dietzgen R G, Twin J, Talty J, Selladurai S, Jones R.Genetic variability of Tomato spotted wilt virus in Australia and validation of real time RT-PCR for its detection in single and bulked leaf samples[J/OL]. Ann Appl Biol, 2005, 146(4):517-530. DOI:10.1111/j.1744-7348.2005.040155.x.
• [23]Onozuka N, Ohki T, Oka N, Maoka T. Detection of four major potato viruses in Japan using a simple RNA preparation and one-step multiplex RT-PCR[J/OL]. J Gen Plant Pathol, 2020, 86(5):290-299. DOI:10.1007/s10327-020-00923-5.
• [24]Liu H, Wu K, Wu W, Mi W L, Hao X G, Wu Y F. A multiplex reverse transcription PCR assay for simultaneous detection of six main RNA viruses in tomato plants[J/OL]. J Virol Methods, 2019(3), 265:53-58. DOI:10.1016/j.jviromet.2018.12.011.
• [25]Minutolo M, Serio F D, Cinque M, Lombardi P,Navarro B. Simultaneous detection of citrus concave gum-associated virus(CCGaV)and citrus virus A(CiVA)by multiplex RT-PCR[J/OL]. J Plant Pathol, 2020,102(3):655-661. DOI:10.1007/s42161-020-00542-1.
• [26]Feng X Y, Wang W Z, Shen L B, Wang J G, Xiong G R, Feng C L, Zhao T T, Zhang S Z. Multiplex RTPCR assay for the simultaneous detection and identification of five sugarcane viruses[J/OL]. Sugar Tech, 2020, 22(4):662-670. DOI:10.1007/s12355-020-00805-2.
• [27]KomínkováM, Komínek P. Development and validation of RT-PCR multiplex detection of grapevine viruses and viroids in the Czech Republic[J/OL]. J Plant Pathol,2020, 102(2):511-515. DOI:10.1007/s42161-019-00452-x.
• [28]蒋素华，程喜梅，宋彩霞，许申平，梁芳，崔波.三种甘薯病毒多重RT-PCR检测技术的建立[J/OL].植物保护，2017, 43(1):126-130. DOI:10.3969/j.issn.0529-1542.2017.01.021.
• [29]Xu Y X, Yang L J, Zhou J, Yang Y, Li S F. Multiplex RT-PCR to simultaneously detect three viruses that infect peach[J/OL]. Lett Appl Microbiol, 2019, 69(5).DOI:10.1111/lam.13220.
• [30]Asano S, Matsushita Y, Hirayama Y, Naka T.Simultaneous detection of Tomato spotted wilt virus,Dahlia mosaic virus and Chrysanthemum stunt viroid by multiplex RT-PCR in dahlias and their distribution in Japanese dahlias[J/OL]. Lett Appl Microbiol, 2015, 61(2):113-120. DOI:10.1111/lam.12442.
• [31]李瑾，毛乃颖，秦萌，胡秀梅，杨梦婕，王淼，张晨，许文波，马学军. GeXP多重PCR技术同时检测12种常见呼吸道病毒[J/OL].病毒学报，2011, 27(6):526-532. DOI:10.13242/j.cnki.bingduxuebao.002218.
• [32]张超，董怡衡，岳苗，卫唯，张谦，王乐，尹卫，王煜伟，梁健.乐都紫皮大蒜4种病毒多重RT-PCR检测技术的建立[J/OL].西北农林科技大学学报（自然科学版），2023, 51(1):120-129. DOI:10.13207/j. cnki.jnwafu.2023.01.014.
• [33]吐逊艾力·艾孜提力，侯婉莹，郭庆元，古丽尼沙·卡斯木，代毅，李世访，麦合木提江·米吉提.三种无花果病毒的多重RT-PCR检测[J/OL].分子植物育种，2021,19(16):5414-5420. DOI:10.13271/j.mpb.019.005414.
• [34]黄广学，孟利前，朱建晨，张进，李庞博，肖海峻.甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）和矮化退绿病毒（SPCSV）的双重RT-PCR检测技术体系构建[J/OL].沈阳农业大学学报，2018, 49(6):724-729. DOI:CNKI:SUN:SYNY.0.2018-06-012.
• [35]罗文彬，李华伟，汤浩，邱思鑫，纪荣昌，许泳清，刘中华，邱永祥.马铃薯5种病毒多重PCR检测技术的建立及应用[J/OL].园艺学报，2015, 42(2):280-288.DOI:10.16420/j.issn.0513-353x.2014-0807.