病毒学报

2021, v.37(03) 605-612

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一种简单有效的基于阳离子交换层析的重组腺相关病毒纯化方法
A Simple and Effective Purification Method of Recombinant Adeno-associated Virus Based on Cation Exchange Chromatography

周豪杰;王晨旭;马强;李媛;高传玉;张守涛;

摘要(Abstract):

本研究旨在探索出一套简单有效的重组腺相关病毒(rAAV)纯化方法,为基因治疗提供有力载体,推进rAAV的基因治疗走进临床。我们选用国际通用的无辅助病毒包装体系,将pAAV-cTnT-eGFP,pAAV-R2C9和pHelper三种质粒共转染HEK 293T细胞系进行病毒包装,并通过荧光显微镜观察包装效率;应用阳离子交换层析法对收获处理后的病毒液进行纯化,包括第Ⅰ轮高pH下的除杂纯化和第Ⅱ轮以严格密集梯度洗脱为特点的进一步纯化。通过SDS-PAGE和Western Blot(WB)对纯化产物进行检测,使用Q-PCR法测定病毒滴度,最后再通过透射电镜对病毒颗粒进一步验证和分析。荧光显微镜结果显示,病毒包装效率较高,可达70%~80%;SDS-PAGE结果表明病毒纯化效果显著,第Ⅰ轮纯化除去了大量的蛋白杂质,第Ⅱ轮纯化也明显除去部分杂质;WB和电镜结果证明,纯化产物实为rAAV病毒,经Q-PCR测得病毒的滴度可达2.15×1012GC/mL,而且电镜进一步观察到我们纯化的终成品病毒中空颗粒含量极少,包含基因的实心颗粒占比可达99%。本研究成功开发出了一套的简单方便、切实有效的rAAV纯化方法,并且该方法能有效去除空壳病毒,提高包含基因的实心病毒占比。

关键词(KeyWords): 重组腺相关病毒;离子交换层析;rAAV纯化

Abstract:

Keywords:

基金项目(Foundation): 国家自然科学基金(项目号:U1604184),题目:VEGF165影响心肌细胞膜L型钙通道电流在缺血再灌注中的机制研究~~

作者(Author): 周豪杰;王晨旭;马强;李媛;高传玉;张守涛;

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DOI: 10.13242/j.cnki.bingduxuebao.003905

参考文献(References):

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