病毒学报

2021, v.37(06) 1410-1419

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KSR2基因3'UTR双荧光素酶报告基因载体构建及其与hcmv-miR-UL70-3p和hcmv-miR-US4-3p靶向关系验证
Construction of the 3'-UTR Dual Luciferase Reporter Vector of the KSR2Gene and Verification of Its Targeting Relationship with hcmv-miR-UL70-3p and hcmv-miR-US4-3p

李池慧;陶然;李华美;李伟;尚世强;张钧;

摘要(Abstract):

人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)的miR-UL70-3p和miR-US4-3p是HCMV microRNA(miRNA)家族中的一员,前期经生物信息学分析发现,Ras激酶抑制剂2(Kinase Suppressor 2 of Ras,KSR2)的3'-UTR区为miR-UL70-3p和miR-US4-3p的高度可疑结合靶点。为进一步鉴定miR-UL70-3p和miR-US4-3p与KSR2基因的靶标关系,本研究通过构建GV272-KSR2-3'UTR野生和突变型载体,进行双荧光素酶(Luciferase)报告基因实验,并测定其荧光值活性的方法判定miR-UL70-3p和miR-US4-3p是否能与KSR2基因结合。先将293T细胞复苏、扩增并进行质粒转染,转染分6组,每组重复做3孔,分组分别为(1)KSR2-3'UTR阴性载体与miRNA无关序列载体(2)KSR2-3'UTR阴性载体与miRNA有效序列载体(3)KSR2-3'UTR野生序列载体与miRNA无关序列载体(4)KSR2-3'UTR野生序列载体与miRNA有效序列载体(5) KSR2-3'UTR突变序列载体与miRNA无关序列载体(6) KSR2-3'UTR突变序列载体与miRNA有效序列载体。酶切及DNA测序结果显示GV272-KSR2-3'UTR双荧光素酶报告基因载体构建成功。Luciferase检测显示:同一Luciferase质粒转染的两个组中,将miRNA-NC组Luciferase相对表达量均一化为1,即将实验组(1)(3)(5)均一化为1后,比较实验组(3)和(4)组、(5)和(6)组、(4)和(6)组之间的Luciferase检测结果,显示实验组(4)和实验组(3)相比,有显著性降低(P<0.05),实验组(6)和实验组(5)相比,实验组(6)和实验组(4)相比,差异具有统计学意义(P<0.05),说明hcmv-miR-UL70-3p和hcmv-miR-US4-3p可与KSR2-3'UTR结合,抑制KSR2表达。

关键词(KeyWords): 人巨细胞病毒(HCMV);Ras激酶抑制剂2(KSR2)基因3'UTR;hcmv-miR-UL70-3p;hcmv-miR-US4-3p;Luciferase实验

Abstract:

Keywords:

基金项目(Foundation): 国家自然科学基金(项目号:81971422),题目:宿主环状RNAhsa_circ_0094088通过病毒miRNA调控人巨细胞病毒增殖的相关机制研究;; 浙江省公益技术研究计划/分析测试项目(项目号:LGC19H200006),题目:基于实时荧光核酸恒温扩增检测技术诊断人巨细胞病毒活动性感染的研究;; 浙江省自然科学基金项目(项目号:LY21H040002),题目:细胞焦亡及其关键效应分子GSDMD在人巨细胞病毒复制中的作用;; 浙江省公益技术研究计划/分析测试项目(项目号:LGC21H200003),题目:基于液滴数字PCR技术的SLE合并HCMV感染患者血浆circRNA筛选及临床应用~~

作者(Author): 李池慧;陶然;李华美;李伟;尚世强;张钧;

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DOI: 10.13242/j.cnki.bingduxuebao.004060

参考文献(References):

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